笔记

2022.08.08

单细胞转录组测序，single-cell RNA-sequencing（scRNA-seq），与传统的转录组测序不同，该技术可以在单细胞水平上揭示所有基因的表达情况，通过研究细胞间的表达异质性、不同细胞类型出现的时序性等，可以用来揭示组织中存在哪些细胞类型（或亚群）、研究细胞分化过程或者不同分化阶段中基因表达的差异、特定细胞类型（或亚群）中蛋白表达差异、检测和分析组织中新的（或稀有的）细胞类型等。

目前常用的是10x Genomics平台。简单来说， （1）首先将组织裂解为单细胞； （2）利用微滴技术将单个细胞和一个凝胶珠包裹在一个油滴中；这个凝胶珠是经过特殊设计的，含有磁珠和凝胶珠，在凝胶珠上有一段序列，这段序列包含（a）测序序列，用于后续测序；（b）一个条形码，成为Barcode，这个barcode是识别单细胞的关键，Barcode越长，可以标示的细胞数越多，如一段11bp的序列可以区分4^11，约400万个细胞；（c）10bp的UMI序列，用于区分不同的RNA表达量（因为不同基因的扩增偏好性不同），相同的UMI代表一个扩增量，即相同的UMI标签的PCR产物被认为是同一个RNA来源；（d）ploy(dT)VN，用于与mRNA的polyA结合； （3）收集油滴，细胞裂解释放mRNA，在油滴内进行逆转录，获得带有Barcode和UMI信息的cDNA一链； （4）油滴破碎，通过磁珠收集所有cDNA一链，进行PCR扩增； （5）扩增完成后，将cDNA打断，建立文库，测序，并进行数据分析。

用于区分细胞类型的方式：每种细胞类型都有特定的基因表达特征，使用不同的细胞标志物来区分类群，这个细胞标志物可以通过文献或者数据库（如cellmarker数据库）来指定。