CRISPR/Cas9

质粒

pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0, Plasmid #62988, addgene ( PX459 , Puro)

pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458), Plasmid #48138, addgene ( PX458 , GFP)

---

酶切情况

酶切位点区域序列

5‘ TGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAG 3’

3‘ ACCTTTCCTGCTTTGTGGCCCAGAAGCTCTTCTGGACAAAATC 5’

BbsI（BpiI）酶切位点为

5' GAAGACN₂↓3'

3' CTTCTGN₆↑ 5'

质粒被双酶切处理后线性化为

5‘ TGGAAAGGACGAAA--------------------GTTTTAG 3’

3‘ ACCTTTCCTGCTTTGTGG--------------------ATC 5’

---

合成序列

由酶切信息，合成引物序列为：

正向引物：CACC-N₂₀

反向引物：AAAC-N_20rc

N₂₀为通过网站（如E-CEISP）设计的guideRNA序列。 获得的sgRNA序列为N₂₀+NGG形式，如GGGGCCACTAGGGACAGGAT NGG，需要合成的序列不包括NGG部分，NGG称为PAM序列，Cas9对DNA进行切割时，切割位点在PAM序列前第3个碱基和第4个碱基之间，此处，切割位点在GGGGCCACTAGGGACAG｜GAT NGG

正向引物为：CACC + sgRNA 正向序列

反向引物为：AAAC + sgRNA 反向互补序列

特别的，如果N₂₀的第一个碱基为非G，需补加一个G。【因U6 human promoter转录时需要起始碱基为G】，此时引物设计变为：

正向引物：CACC-GN₂₀

反向引物：AAAC-N_20rC

---

酶切连接

连接产物（合成部分示为棕色）为：

5‘ -----TGGAAAGGACGAAACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAG -----3’

3‘ -----ACCTTTCCTGCTTTGTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATC -----5’

---

---

基因外显子查找网站

e! Ensembl

使用教程

---