NGN2神经元诱导方案

诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元（iNs）是用于模拟人类神经系统疾病的宝贵工具。

目前，生成iNs广泛采用两种方法。

经典的定向分化（Directed Differentiation, DD）方法旨在重现已知的神经发生信号线索，并能够精准确定神经元的特定区域身份。然而，该方法通常需要数周时间才能生成成熟且具有功能的神经元，且技术要求较高。此外，分化后的细胞群体中常常含有非目标的抑制性神经元和星形胶质细胞，其比例在很大程度上取决于iPSC细胞系的内在特性。

近年来，转录因子过表达方法在快速生成目标细胞类型方面越来越受欢迎。研究发现，过表达 NEUROG2（NGN2）可在1周内将iPSC驱动成兴奋性神经元。与定向分化（DD）方法相比，该方法速度更快，且对技术专业性的要求较低。

自首个发表的方法以来，NGN2-iN方案在可重复性和目标细胞类型方面已得到显著改进。早期方案使用慢病毒引入多西环素（dox）诱导的NGN2转基因，这有可能导致基因组异常和批次间变异性。此外，在需要数十亿神经元的大规模筛选实验中，慢病毒可能成为规模扩大和设施可及性的限制因素。为解决这一问题，近期方案采用将可诱导NGN2基因工程化插入到iPSC细胞系安全港位点的细胞系。细胞系的单克隆性降低了批次间的变异性。后续改进则通过在神经诱导过程中引入定向分化（DD）因子，以获得更均一且具有特定区域身份的神经元类型。

除了神经诱导阶段之外，iN的成熟方案仍有进一步改进的空间。大多数方案需要与星形胶质细胞共培养，以促进神经元的成熟和电生理活性。这引入了额外的变异性，并且往往抵消了NGN2方案在生成相对均一细胞类型上的优势。此外，与星形胶质细胞共培养也增加了下游分析的复杂性。在表征数据方面，已发表的大多数数据都集中在早期NGN2 iN（分化至第4周以内）。这使得评估某个方案是否适用于需要更成熟神经元的研究变得困难。

对iPSC 来源神经元成熟状态的认识不足，也源于缺乏公认的成熟标志物和检测方法。之前的研究主要通过单个或少数几个基因的表达水平来判断iN是否成熟。这些基因虽然能在一定程度上反映神经元成熟的某些方面，但并不能全面涵盖成熟的概念，例如离子通道的整合、细胞骨架重构，以及细胞间和细胞与细胞外基质的相互作用。

在本研究中，我们整合了上述最新进展，并解决了关键的技术瓶颈，成功实现了大规模、长期稳定培养的谷氨酸能NGN2-iN。我们对细胞进行了长达56天的全面表征，为后续研究提供了参考数据。基于这些表征数据，我们开发了神经元成熟检测方法，并验证了这些NGN2-iN用于模拟神经系统疾病的适用性。最后，我们报道了一种构建可诱导NGN2 iPSC细胞系的方案，该方案与本研究中使用的商业化细胞系类似。综上，本研究为开发稳健的神经系统疾病体外模型提供了强有力的工具。

实验模型与研究对象详细信息

细胞（人或小鼠来源）培养条件为 37°C、5% CO₂、常氧（ambient O₂）和湿度 >90%。细胞工程中的冷休克步骤在 32°C、5% CO₂、常氧和湿度 >90% 的条件下进行。

iPSC 细胞系 iP11N 和 iPS11 购自 ALSTEM 公司。iNgn2-dCas9-KRAB-cloneG12（简称“G12”）细胞系由 ALSTEM 公司定制生产。ALSTEM 的 iPSC 细胞系来源于该供应商从一名男性供体的包皮成纤维细胞诱导获得，供体进一步信息无法获取。KOF2.1J iPSC 细胞系购自 Jackson Laboratory，其亲代细胞系的原始供体为一名 55–59 岁的白人男性。

从供应商处获得的细胞使用 mTeSR Plus 培养基在 Matrigel 包被的培养皿上复苏，并补充 CloneR2 培养一天（传代 0，P0）。之后每隔一天更换培养基。当细胞汇合度达到 75% 时，使用 ReLeSR 在 37°C 下处理 5 分钟，将 iPSC 以细胞团块形式按 1:6 的比例进行传代。P1 代的 iPSC 接种于 iMatrix 511 包被的培养皿中，在汇合度达到 75% 时以细胞团块形式用 CryoStor CS10 进行冻存。每个 6 孔板孔生成 4 支冻存管，冻存管储存于液氮罐中。

方法详细信息

iPSC 质量控制（iPSC QC）

iPSC 细胞系的质量控制包括：支原体检测（MycoAlert，每维持培养 2 周进行一次），以及使用 STEMCELL 遗传分析试剂盒（每 5 个传代进行一次）快速检查基因组完整性。在冻存建库前，细胞需进行以下检测：Karyostat+ 检测（高分辨率基因组完整性）、胚胎体（Embryoid body）自发分化结合 ScoreCard 测试（评估多能性和谱系倾向）、细胞形态学检查，以及免疫荧光（IF）检测多能性标志物（Sox2、Nanog、Oct3/4）。

ScoreCard 结果要求：未分化的 iPSC 应显示无分化迹象；分化的胚胎体（EBs）在三个胚层谱系上应显示平均或偏高的得分。所有 iPSC 均需在免疫荧光检测中呈多能性标志物阳性。

复苏后的 iPSC 需培养并传代 2 周（共 4–5 个传代），之后再进行 NGN2 神经元诱导。诱导前，iPSC 培养物中不得有任何肉眼可见的分化细胞。

靶向基因工程构建可诱导 NGN2 细胞系

Kof2.1J 细胞系在 Geltrex（1:50 稀释于预冷的 DMEM/F12 中）包被的 6 孔板上复苏，培养至汇合度约 70%。

工程改造第 0 天：用 Geltrex 包被 24 孔板 1 小时。mTeSR Plus 培养基中补充 1× CloneR2（stemcell，#100-0691） 和 1× HDR Enhancer V2（IDT，#10007921），每孔加入 2 mL 该培养基，置于 32°C、5% CO₂ 培养箱中。分别准备 2 个孔用于编辑细胞和未转染对照。

将 4 μL sgRNA（125 pmol/mL，溶于 TE 缓冲液）与 2 μL HiFi Cas9 核酸酶 V3（IDT，#1081061）混合，在室温孵育 30–45 分钟以形成 RNP 复合物。细胞用 Accutase 消化（方法同前，50 μL/cm²，37°C 10 分钟），此密度下预计每孔可获得 300 万细胞，存活率应高于 95%。取两管各 100–150 万细胞离心沉淀。其中一管用 20 μL 补充过的 P3 Primary Cell Nucleofector Solution（Lonza）轻轻重悬，并加入预先形成的 RNP 复合物。立即加入供体质粒（2 μg，浓度 1 μg/μL，序列见 Data S3），然后将全部混合物转移至 16 孔 Nucleocuvette Strip（Lonza）的一个孔中。第二管细胞沉淀用 20 μL P3 溶液重悬后转移至另一孔。使用 4D-Nucleofector X Unit（Lonza），以 CM113 程序进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞稀释于 100 μL 预热的 24 孔板培养基中，并转移回 24 孔板。迅速放回 32°C 培养箱。

第 1 天：转染孔中约 1/3 的细胞应可见红色荧光，且汇合度至少达到 50%。更换为不含补充因子的 mTeSR Plus 培养基，继续置于 32°C 培养箱。

第 2 天：转染孔和对照孔均更换为含有 4 μg/mL 博来霉素（Blasticidin）和 CloneR2 的 mTeSR Plus 培养基。放回 37°C 培养箱培养两天。

第 4 天：对照孔中的细胞应已全部死亡。将转染孔的细胞用 Accutase 消化成单细胞，按 1:5 系列稀释接种到 4 个 10 cm 培养皿中。用补充 CloneR2 的 mTeSR Plus 培养 2 天后，撤除 CloneR2，继续培养 3 天，每隔一天换液。观察培养皿，挑选具有分散良好、红色荧光均匀的单克隆。

第 9 天：换液时加入 4 μg/mL 博来霉素，继续培养两天。

第 11 天：检查 10 cm 培养皿中的克隆密度。对于克隆密集、融合的培养皿，用 Accutase 消化后用 CryoStor CS10 冻存，储存于液氮罐；对于克隆分散良好的培养皿，在配备红色荧光通道的 EVOS M5000 显微镜下挑取单克隆。挑选边缘光滑、红色荧光均匀且与其他克隆分离良好的克隆，用 200 μL 移液器（设定为 100 μL）带枪头挑取。每个克隆分成 3–4 小块，分别转移至：

扩增板：Geltrex 包被的 96 孔板，每孔含 100 μL mTeSR Plus；

表型板：iMatrix-511 包被的 96 孔板，每孔含含 6 μg/mL 强力霉素（R&D，#4090/50）的 mTeSR Plus；

基因型板：未包被的 V 型底 96 孔板，用于收集细胞沉淀进行基因型鉴定。

扩增板每隔一天换液（mTeSR Plus）；表型板每天用 NGN2 诱导培养基换液。基因型板的细胞沉淀用 QuickExtract 提取 gDNA，并用 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix 进行 PCR 基因型鉴定。选择成功分化、通过基因型鉴定且无明显嵌合荧光模式的克隆继续培养。

第 18 天：将阳性克隆传代至 Geltrex 包被的 6 孔板中，进行进一步质控和主细胞库制备。细胞通常在 5–7 天内达到 50% 以上汇合度。